荧光定量PCR技术及其应用
荧光定量PCR（也称TaqMan PCR,以下简称FQ-PCR）是1995年研制出来的一种新的核酸定量技术，该技术是在常规PCR基础上加入荧光标记探针来实现其定量功能的，与变通PCR相比，FQ- PCR具有许多优点。
1 特点
FQ-PCR不仅具有普通PCR的高灵敏性，而且由于荧光探针的应用，可以通过光电传导系统直接探测PCR扩增过程中荧光信号的变化以获得定量结果，所以还具有DNA杂交的高特异性和光谱技术的高**性，克服了常规PCR的许多缺点。如一般PCR产物都需通过琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色紫外光观察结果或通过聚****凝胶电泳和银染检测，不仅需要多种仪器，而且费时费力，所使用的染色剂溴化乙锭对人体又有害，这些繁杂的实验过程又给污染和假阳性提供了机会。
具有以下特点：
①应用广泛：可用于DNA和RNA的PCR产物定量、基因表达研究、病原体检测及PCR条件的优化等。
②独特的定量原理：采用荧光标记探针，经激光激发后荧光量随PCR循环而累积，从而达到定量目的。
③工作效率高：内置9600型PCR扩增仪，电脑控制1～2小时全自动同步完成96个样品的扩增及定量。
④无须凝胶电泳：无须对样品进行稀释和电泳，只须通过特殊探头在反应管内直接检测。
⑤无管道内污染：采用独特全封闭反应管及光电传导系统，无须顾及污染。
⑥结果重现性好：定量动态范围高达五个数量级。
所以自从此项技术研制成功以来，受到许多科研工作者的重视并在多个领域得到应用。
2 原理和方法
FQ-PCR的工作原理是利用Taq酶的5’→3’外切酶活性，在PCR反应系统中加入一个荧光标记探针。该探针可与引物包含序列内的DNA模板发生特异性杂交，探针的5’端标以荧光发射基因FAM（6-羧基荧光素，荧光发射峰值在518nm处），靠近3’端标以荧光淬灭基团TAMRA（6-羧基四甲基若丹明，荧光发射峰值在582nm处），探针的3’开端被**化以防止探针在PCR扩增过程中被延伸。当探针保持完整时，淬灭基团抑制发射基团的荧光发射。发射基团一旦与淬灭基团发生分离，抑制作用被解除，518nm处的光密度增加而被荧光探测系统检测到。复性期探针与模板DNA发生杂交，延伸期Taq酶随引物延伸沿DNA模板移动，当移动到探针切断，淬灭作用被解除，荧光信号释放出来。模板每复制一次，就有一个探针被切断，伴随一个荧光信号的释放。由于被释放的荧光基团数目和PCR产物数量是一对一的关系，因此用该技术可对模板进行准确定量。实验仪器一般使用 PCR扩增仪，也可用其它PCR仪。RQ+代表样品管荧光发射基团发光强度与淬灭基团发光强度的比率，RQ-代表空白管中二者的比率，△RQ（△RQ=RQ+-RQ-）代表PCR过程中荧光信号变化量，经过数据处理，即可得出定量结果。由于荧光探针的引入，显著提高了实验的特异性。
探针设计一般应符合以下条件：
①探针长度应在20～40个碱基左右，以保证结合的特异性。
②GC碱基含量在 40%～60%，避免单核苷酸序列的重复。
③避免与引物发生杂交或重叠。
④探针与模板结合的稳定程度要大于引物与模板结合的稳定程度，因此探针的Tm值要比引物的Tm值至少高出5℃。
另外，探针的浓度、探针与模板序列的同源性，探针与引物的距离都对实验结果有影响。
3 应用
由于FQ-PCR具有高灵敏性，高特异性和高**性的特点，目前，该项技术已被应用于病原体测定、肿瘤****、免疫分析、基因表达、突变及其多态性的研究等多个领域。
3.1病原体测定
由于PCR技术的问世，使得病原体检测能够快速而方便的进行。但由于其高灵敏性，实验操作很容易受到污染而出现假阳性。只要有微量病原体存在，PCR扩增即可为阳性结果，但并不能作为诊断依据，只有当一定数量的病原体存在时才有临床意义，因此结模板定量显得特别重要。常规PCR由于不能定量而限制了其应用，然而，PE公司研制的FQ-PCR技术给解决这一问题提供了可能。目前该技术已经应用于丙肝病毒、人类乳头瘤病毒、结核杆菌和食品中大肠杆菌等许多病原体的检测研究。 Morris等用FQ-PCR对黑猩猩丙型肝炎动物模型和临床丙型肝炎患者血清中丙肝病毒（HCV）进行了研究。测定显示，可测得的样品浓度相当于每毫升13个基因组。与巢式PCR比较显示，FQ-PCR有着与巢式PCR相同的敏感性。另外，还对48例临床丙型肝炎病人血清样品进行了测试，32例样品两种检测方法均为阳性，10例均为阴性；另有6例用两种方法测定的结果不一致。该6例样品又让第三个实验室用巢式PCR方法重新测定，其结果与FQ- PCR测定的结果一致率为****。FQ-PCR技术在保持巢式PCR高度敏感性的同时又能提高效率，因此可作为一种检测HCV的有效方法。同时，由于 FQ-PCR可以测出血清中病原体浓度，故可给药物治疗及疗效观察提供参考依据。与宫颈癌及其癌前病变有关的人类乳头瘤病毒（HPV）有多种类型，以HPV-16、18、31、33、35等类型危险性**。Swan等1997年用FQ-PCR技术对子宫阴道灌洗标本进行了研究。
他们发现，由于荧光探针的应用，对各型HPV的检测变得十分方便和准确。由于HPV-16的特异引物可以和HPV-66的模板DNA发生错配，用一般PCR 方法扩增时，如有HPV-66存在，即可扩增出HPV-66片段而发生误诊，但是HPV-16特异探针的应用使HPV-66在TaqMan系统中不能扩增。因此，FQ-PCR对不同亚型的病毒检测具有高度特异性。同时也发现FQ-PCR具有高度敏感性，用一般PCR方法检测不到的HPV模板浓度在 TaqMan系统中却可检测到。对于HPV-16、18、31、33、35类型敏感高达到每100～1000个细胞中含有一个拷贝的HPV基因组，平均每 300个细胞中含有一个拷贝的HPV基因组。
以前常规检测大肠杆菌的方法，都是采用多种选择性培养基培养分离法，对产志贺氏毒素的大肠杆菌（SLTEC）缺乏特异性，因此这种菌株的检测又费时又困难。后来又有应用抗体的免疫学方法和核酸序列测定的生化方法及以DNA扩增为基础的PCR方法等，都因为繁琐，需要大量的PCR后处理过程及不能对标本定量而受到限制。美国Witham等1996年将FQ-PCR技术应用于牛肉中大肠杆菌志贺氏毒素基因的检测研究。针对不同血清变异型的大肠杆菌，他们设计应用不同的探针，从而提高了实验特异性。他们同时还对探针相对于引物的位置、反应液中探针浓度、镁离子浓度等影响实验的因素进行了优化实验，以提高实验的准确性和**性。由于TaqMan系统可以一次测量96管样品，还可对模板进行准确定量，又不需要进行电沪及EB染色后处理过程，实际应用方便，从而提高了实验的参考价值和应用价值。因此该实验方法是食品检测方面的一个突破。此外，加拿大 Chen等1997年也把FQ-PCR技术用于食品中沙门氏杆菌的检测研究。在抗痨治疗开始后，结核病人痰中可持续存在有结核杆菌，为了研究结核病人痰标本DNA定量结果是否与有活力的结核杆菌数量相符合并监测治疗反应，1998年美国Desardin等用FQ-PCR和竞争性PCR 两种方法定量检测治疗期间连续收集的结核病人痰标本，结果显示两种方法有较好的重复性和准确性。痰中结核杆菌DNA定量结果与抗酸染色显微镜下计数的结果一致。
3.2肿瘤研究
意大利Gelmini等用FQ-PCR技术检测乳腺癌标本c-erbB-2基因拷贝数目变异情况。他们以β- 肌动蛋白基因为参照探索**实验条件，当扩增循环数在28～31之间时，△RQ与模板DNA有着较好的剂量依赖关系。他们在此条件下扩增了c-erbB- 2基因和β-球蛋白基因，发现△RQ都与各自的模板DNA浓度存在着线性关系，虽然二者斜率不同，但是各个实验浓度下二者的△RQ之比却是恒定的。说明尽管二者发光效率不同，却不影响定量效果。为了检验FQ-PCR的准确性和对不同基因拷贝数的分辨率，他们将c-erbB-2基因的DNA样本用正常** DNA做不同倍数稀释后进行实验，测得的结果与期望值高度相关（r=0.997）。他们将实验数据与Southern印迹结果和已报告的竞争性PCR结果比较都显示高度相关性（n=25，r=0.94，P<0.01）。1998年法国bieche等用fq-pcr测定了108例乳腺癌标本。他们选择扩增频率较高的myc、ccnd1和erbb2基因进行扩增，在108例标本中，发现10%的myc基因、23%的ccnd1基因和15%>
3.3基因表达研究
由于TaqMan系统及荧光探针的应用，对mRNA的检测显得较以前常用的方法如Northern印迹、RT-PCR定量法要方便、快速、准确得多。为了探测**基质血小板生成因子（TPO）在巨核细胞生成过程中的作用以及血小板生成因子在特发性血小板减少性紫瘢（ITP）、再生障碍性贫血（AA）和特发性血小板多症（ET）等疾病过程中的病理生理意义，日本Hirayama等用TaqMan EZ RT-PCR试剂盒在ABI7700反应系统测定了正常人和ITP、AA、ET病人的**基质细胞TPO mRNA水平，又用ELISA方法测定了**和末梢血的TPO浓度。结果显示ITP和AA病人TPO mRNA水平明显升高，而ET病人的TPO mRNA水平则正常，经类固醇治疗后ITP病人TPO mRNA水平下降；**TPO的浓度与其 mRNA水平有相关性；在正常人和ITP病人，TPO mRNA表达水平与巨核细胞计数也有相关性。这个实验对阐明TPO 的作用提供了依据。日本Shimokawa等也用FQ-PCR技术对鼠成肌细胞系C2C12中肌肉调节因子的表达水平及动态变化进行了研究。
3.4免疫组份分析
对免疫T细胞群体V-β组份进行分析是研究健康和疾病免疫应答反应的重要手段，可通过流式细胞法或RFQ-PCR法来进行。流式细胞法是通过对细胞群体进行直接而方便的V-β表达方面的研究，但需要一整套单克隆抗体和大量细胞来进行染色分析，而且人类V-β特异性抗体尚不完备，因此该方法有许多不便之处。如果用FQ-PCR方法，即不需要大量细胞，引物设计也很方便，而且已有多种定量方法，包括锚式PCR法、半定量PCR法、竞争性PCR法等，但都因PCR产物的后处理过程需凝胶电泳、EB染色和光密度测量等既费时，又降低了准确性，还增加了污染机会，使得FQ-PCR的应用受到限制。1997年Lang等用FQ-PCR技术进行实验，从而避免了这些问题，他们在反应系统中引入荧光探针，将下游引物与探针固定，然后，针对不同的V-β成份，选用特异的上游引物进行扩增，再对反应中产生的荧光信号进行处理，即可获得各个成份的数据。
3.5基因突变及多态性的研究
美国Ibrahim等1997用FQ-PCR技术对正常痘病毒多态性进行了研究。他们采用一对可与正常痘病毒血凝素基因的某一DNA片段结合的引物，并设计两个有单核苷酸差异的寡核苷酸探针，用荧光标记后进行实验，顺利地把有此单核苷酸差异的两个痘病毒株进行鉴定。该技术也可用于猴痘和病毒DNA 疫苗的单核苷酸变异多态的研究。
3.6其他方面
日本Isono利用FQ-PCR进行叶绿体成熟度与其基因组拷贝数关系的研究。他们以核基因Cab作为内参照，进行叶绿体基因rbc1拷贝数测定，结果发现子叶出现以后，叶绿体基因拷贝数显著增加，进而把叶绿体的基因拷贝数增加与光诱导的叶绿体成熟过程联系起来。1998年美国Higgins等还建立起一套用荧光探针检测鼠疫纤溶酶原激活基因（pla）的实验方法。
4 结语
综上所述，FQ-PCR作为一种核酸定量技术，应用较多且较成熟的主要是在病原体检测方面，其优越性在此方面也得以充分体现。因此将该项技术进一步开发应用于临床，具有很大潜力。但是在遗传病和肿瘤研究方面，尤其是基因表达的研究，该技术目前应用的还较少，在此方面加强研究应用，将会有广阔的前景。
亿森宝生物：PCR产品介绍
关键词：自主研发，颠覆，**的，国内知名的检测试剂盒生产厂家
序言
北京亿森宝生物科技有限公司（下简称亿森宝生物）是一家产学研相结合、科工贸一体化的，集临床、食品安全及动物防疫检验试剂的研发、生产、销售及技术服务为一体的中国大型生物医药高科技企业，隶属于***、北京市及开发区的高新技术企业。
公司自成立以来，不断加快科技创新、自主品牌建设步伐，申请多项**发明专利，同时公司重视与国内外研究机构、高校、生物医药同行公司的合作与交流，不断增强自主创新能力，重视自主知识产权建设，研发的产品疾病预防控制中心、动物疫病预防控制中心、食品安全检测以及宠物疾病等多方面，其中一些产品的技术已形成企业核心竞争力。
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荧光定量PCR技术基础理论
基本概念：
荧光定量PCR技术是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号随着PCR反应的积累来实时监控PCR反应的进程，并通过分析软件对PCR的反应进行检测分析的技术。
系统组成：
定量PCR仪、电脑、分析软件、试剂及耗材。
反应条件：
预变性： 94℃，2-10min
变 性： 94℃, 30s, 模板DNA变性成为单链
退 火： Tm-5℃,30s，引物与模板DNA结合
延 伸： 72℃，DNA聚合酶催化DNA合成时间与待扩增片段长度有关，<1Kb,1min；>1Kb，延长时间重复25-30cycle。
**延伸：72℃， 10min。
实时定量PCR技术：
利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的关系对起始模板进行定量分析。
与常规 PCR技术比较：
对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析，无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测。
常用名词：
扩增曲线
荧光阈值
Ct值
品牌简介：
亿森宝生物集研发、生产、销售和技术服务为一体，立足服务于民生的安全健康，专业为客户提供食品安全、动物疫病检测、体外诊断等三大领域产品及技术服务，创建了金标、ELISA、PCR、基因芯片等研发平台及相关试剂盒产品生产线，始终致力于国内***的产品与技术服务，致力于食品安全检测及动物疫病诊断试剂盒专家。
检测分类：
v 食源性微生物致病菌检测
v 食品过敏原检测
v 食品转****
v 动植物物种鉴定
v 微生物采样试剂盒
v 微生物加工前处理设备
v 乳品中抗生素及兽药残留检测
检测特点：
v 提早检测，防患未然
v 检测**、稳定
v 操作简便、易懂
v 结果安全、可靠
v 提高检测速度