本试剂盒采用碱裂解法裂解细胞,根据离心吸附柱在高盐状态下特异性地结合溶液中的DNA的原理特异性提取质粒DNA。离心吸附柱中采用的硅基质材料能高效、专一地吸附DNA,可**限度去除杂质蛋白及细胞中其他有机化合物。Phygene公司研制的内毒素清除剂,可**限度地除去内毒素。从50-100ml大肠杆菌LB培养液中,可快速提取200-300μg高纯度高拷贝的质粒DNA,提取率达85-90%。使用本试剂盒提取的质粒DNA纯度高,可直接用于细胞转染等要求较高的实验,以及其他各种常规操作,包括酶切、PCR、测序、连接和转化等试验。
使用前请先在漂洗液中加入无水乙醇,加入体积请参照瓶体上的标签。溶液P1在使用前先加入RNaseA(将试剂盒中提供的 RNaseA全部加入),混匀,置于 2-8℃保存。如非指明,所有离心步骤均为使用台式离心机在室温下离心。
使用说明1、取50-100ml细菌培养物,11000rpm离心1min,尽量吸除上清(菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中)。
2、向留有菌体沉淀的离心管中加入4ml溶液P1(请先检查是否已加入RNaseA),使用移液器或旋涡振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀。注意:如果菌块未彻底混匀,会影响裂解导致质粒提取量和纯度偏低。
3、向离心管中加入4ml溶液P2,温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。注意:混匀一定要温和,以免污染细菌基因组DNA,此时菌液应变得清亮粘稠,作用时间不要超过5min,以免质粒受到破坏。
4、向离心管中加入4ml溶液P3,立即温和地上下翻转6-8次,充分混匀,此时会出现白色絮状沉淀。11000rpm离心10min,用移液器小心地将上清转移到另一个干净的离心管中,尽量不要吸出沉淀。注意:溶液P3加入后应立即混合,避免产生局部沉淀。如果上清中还有微小白色沉淀,可再次离心后取上清。
5、加入上清1/5体积的冰上预冷的内毒素清除剂,振荡混匀,溶液变浑浊,冰浴2min至溶液变清亮。
6、37℃水浴5min,不时振荡,溶液又变浑浊。11000rpm室温离心5min,溶液应分为两相,上层水相含质粒DNA,下层油相含内毒素。
7、将含质粒DNA的上层水相转移至新管,弃下层油相,注意不要吸入油状相。重复抽提三次,即重复步骤5-7三次。
8、加入12ml的结合液,充分混匀后加入吸附柱中,室温放置2min,11000rpm离心1min,倒掉收集管中的废液,将吸附柱重新放回收集管中。如果溶液量多可分多次加入。
9、向吸附柱中加入8ml漂洗液(使用前请先检查是否已加入无水乙醇),11000rpm离心1min,弃废液,将吸附柱放入收集管中。
10、向吸附柱中加入6ml漂洗液,11000rpm离心1min,弃废液,将吸附柱放入收集管中。
11、11000rpm离心3min,将吸附柱敞口置于室温或50℃温箱放置数分钟,目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除,否则漂洗液中的乙醇会影响后续的实验如酶切、PCR等。
12、将吸附柱放入一个干净的离心管中,向吸附膜中央悬空滴加1-2ml经65℃水浴预热的洗脱液,室温放置5min,11000rpm离心2min。
13、为了增加质粒的回收效率,可将得到的洗脱液重新加入吸附柱中,室温放置5min,11000rpm离心2min。
注意事项1、溶液P1在使用前先加入RNaseA (将试剂盒中提供的RNaseA全部加入),混匀,置于2-8℃保存。
2、**次使用前应按照试剂瓶标签的说明在漂洗液中加入无水乙 醇配制成工作液(向15ml的漂洗液中加入60ml的无水乙醇)。
3. 使用前请先检查溶液P2、P3和P4是否出现混浊,如有混浊现象,可在37℃水浴中加热几分钟,待溶液恢复澄清后再使用。
4.洗脱缓冲液体积不应少于500ul,体积过小影响回收效率;洗脱液的pH值对洗脱效率也有影晌,若需要用水做洗脱液应保证其pH值在8.0左右(可用NaOH将水的pH值调至此范围),pH值低于7. 0会降低洗脱效率, DNA产物应保存在-20℃,以防DNA降解。
5.质粒DNA浓度>1mg/ml时清除内毒素效率降低。由于质粒DNA本身的性质,清除过程可导致部分质粒DNA丢失,但内毒素却能得到**限度清除。
6. 所有溶液应用无内毒素的高纯水配制,所有器械材料均应不含内毒素,玻璃器皿可高温烘烤,非挥发性水溶液可高压处理。
7. DNA浓度及纯度检测:得到的质粒DNA纯度与样品保存时间、操作过程中的剪切力等因素有关。得到的DNA可用琼脂糖疑胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。DNA应在OD260处有显著吸收峰,OD260值为1相当于大约50μg/ml双链DNA、40μg/ml单链DNA。OD260/OD280比值应为1.7-1.9,如果洗脱时不使用洗脱缓冲液,而使用去离子水,比值会偏低,因为pH值和离子存在会影响吸光值,但并不表示纯度低。
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