本试剂盒采用碱裂解法裂解细胞，根据离心吸附柱在高盐状态下特异性地结合溶液中的DNA的原理特异性提取质粒DNA。离心吸附柱中采用的硅基质材料能高效、专一地吸附DNA，可**限度去除杂质蛋白及细胞中其他有机化合物。Phygene公司研制的内毒素清除剂，可**限度地除去内毒素。从1-5ml大肠杆菌LB培养液中，可快速提取5-15μg高纯度质粒DNA，提取率达85-90%。使用本试剂盒提取的质粒DNA纯度高，可直接用于细胞转染等要求较高的实验，以及其他各种常规操作，包括酶切、PCR、测序、连接和转化等试验。

使用前请先在漂洗液中加入无水乙醇，加入体积请参照瓶体上的标签。溶液P1在使用前先将试剂盒中提供的RNaseA全部加入，混匀，置于2-8℃保存。如非指明，所有离心步骤均为使用台式离心机在室温下离心。

1、取1-5ml细菌培养物，12000rpm离心1min，吸除上清（菌液浓度较低时可多次离心收集到一个离心管中）。

2、向留有菌体沉淀的离心管中加入200μl溶液P1(请先检查是否已加入RNaseA），使用移液器或旋涡振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀。注意：如果菌块未彻底混匀，会影响裂解导致质粒提取量和纯度偏低。

3、向离心管中加入200ul溶液P2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。注意：混匀一定要温和，以免污染细菌基因组DNA，此时菌液应变得清亮粘稠，作用时间不要超过5min，以免质粒受到破坏。

4、向离心管中加入200ul溶液P3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时会出现白色絮状沉淀。12000rpm离心10min，用移液器小心地将上清转移到另一个干净的离心管中，尽量不要吸出沉淀。注意：溶液P3加入后应立即混合，避免产生局部沉淀。如果上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清。

5、加入上清1/5体积的冰上预冷的内毒素清除剂，振荡混匀，溶液变浑浊，冰浴2min至溶液变清亮。

6、37℃水浴5min,不时振荡，溶液又变浑浊。12000rpm室温离心5min，溶液应分为两相，上层水相含质粒DNA，下层油相含内毒素。

7、将含质粒DNA的上层水相转移至新管，弃下层油相，注意不要吸入油状相。重复步骤5-7三次。

8、加入600ul的结合液，充分混匀后加入吸附柱中，室温放置2min，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。如果溶液量多可分多次加入。

9、向吸附柱中加入700ul漂洗液(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放入收集管中。

10、向吸附柱中加入500ul漂洗液，12000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放入收集管中。

11、12000rpm离心2min，将吸附柱敞口置于室温或50℃温箱放置数分钟，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，否则漂洗液中的乙醇会影响后续的实验如酶切、PCR等。

12、将吸附柱放入一个干净的离心管中，向吸附膜中央悬空滴加50-200ul经65℃水浴预热的洗脱液，室温放置2min，12000rpm离心1min。

13、为了增加质粒的回收效率，可将得到的洗脱液重新加入吸附柱中，室温放置2min，12000rpm离心1min。

1. 溶液P1在使用前先加入RNaseA (将试剂盒中提供的RNaseA 全部加入)，混匀，置于2-8℃保存。

2. **次使用前应按照试剂瓶标签的说明在漂洗液中加入无水乙醇配制成工作液 (向15ml的漂洗液中加入60ml的无水乙醇)。

3. 使用前请先检查溶液P2、P3和P4是否出现混浊，如有混浊现象，可在37℃水浴中加热几分钟，待溶液恢复澄清后再使用。

4.洗脱缓冲液体积不应少于50ul，体积过小影响回收效率；洗脱液的pH值对洗脱效率也有影晌，若需要用水做洗脱液应保证其pH值在8.0左右(可用NaOH将水的pH值调至此范围)，pH值低于7.0会降低洗脱效率。 DNA产物应保存在-20℃，以防DNA降解。

5.质粒DNA浓度＞1mg/ml时清除内毒素效率降低。由于质粒DNA本身的性质，清除过程可导致部分质粒DNA丢失，但内毒素却能得到**限度清除。

6. 所有溶液应用无内毒素的高纯水配制，所有器械材料均应不含内毒素，玻璃器皿可高温烘烤，非挥发性水溶液可高压处理。

7.DNA浓度及纯度检测：得到的质粒DNA纯度与样品保存时间、操作过程中的剪切力等因素有关。得到的DNA可用琼脂糖疑胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。DNA应在OD260处有显著吸收峰，OD260值为1相当于大约50μg/ml双链DNA、40μg/ml单链DNA。OD260/OD280比值应为1.7-1.9，如果洗脱时不使用洗脱缓冲液，而使用去离子水，比值会偏低，因为pH值和离子存在会影响吸光值，但并不表示纯度低。

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