1）使用了LysisDye，菌体裂解是否完全一目了然。由于判断菌体裂解和中和是否彻底更主要取决于操作者的经验，所以我们增加了LysisDye（一种能使裂解/中和体系变换颜色的试剂）来帮助观察裂解/中和的程度。加入P1后，LysisDye使菌液变为浑浊的红色；加入P2后，LysisDye立即使溶液变为澄清的红色，裂解是否完全只要观察红色溶液是否澄清，如果红色非常均一，表明裂解充分；在完全裂解的体系中加入P3混匀后，体系立即变为黄色，任何红色的残留表明没有完全混匀或者中和不彻底。

2 ）增加了去蛋白液PD，能更加彻底地去除蛋白污染，得到纯度更高的质粒。

1. 将试剂盒附带的RNase A全部加入到溶液P1中（如15ml P1中加入150μl RNase A），混匀后4℃贮存。

2. 按照标签所示在漂洗液PW中加入无水乙醇，混匀后盖紧瓶盖后室温贮存备用。

3. 每次使用前请检查溶液P2，溶液P3和去蛋白液PD是否有沉淀生成，如果出现沉淀，37℃温浴至沉淀溶解后再使用。

使用LysisDye的标准操作步骤：

如非指出，所有离心步骤均为使用台式离心机在室温下离心。

1. 取1–5 ml过夜培养的菌液加入离心管中，10,000g 离心1分钟，尽量吸除上清。注：菌液较多时可以通过几次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中。

2. 向菌体沉淀的离心管中加入250 μl溶液P1（请先检查是否已加入RNaseA）和5μlLysisDye，使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀，此时溶液为浑浊的红色。注：如果有未彻底混匀的菌块，会影响裂解，导致提取量和纯度偏低。

3. 加入250 μl溶液P2，温和地上下翻转6–8次使菌体充分裂解，此时溶液变为澄清的红色。注：温和地混合，不要剧烈震荡，以免污染基因组DNA；所用时间**不应超过5分钟，以免质粒受到破坏；红色溶液应该透明均一，如有浑浊红色颗粒，表明裂解不充分，会大大降低质粒提取效率。

4.加入350μl溶液P3，立即温和地上下翻转，充分混匀，混匀充分的标志是溶液完全呈透明的黄色，如有可见红色，说明混匀不彻底。10,000g离心10分钟。注：P3加入后应立即混合，避免产生局部沉淀。

5.小心地将上清转移到吸附柱CP中（吸附柱放入收集管中），10,000g离心30–60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP重新放回收集管中。

6. 向吸附柱CP中加入500 μl去蛋白液PD，10,000g离心30秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP重新放回收集管中。

7. 向吸附柱CP中加入700μl漂洗液PW（请先检查是否已加入无水乙醇），10,000g离心30–60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP重新放回收集管中。

8. 向吸附柱CP中加入500 μl漂洗液PW，10,000g 离心30–60秒，倒掉收集管中的废液。

9. 将吸附柱CP置于重新放回收集管中，10,000g 离心2分钟。注：此步骤目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，**不可省略，因为漂洗液中乙醇的残留会影响后续实验（酶切，PCR等）。

10.将吸附柱CP置于一个干净的1.5ml离心管中，向吸附膜的中央部位悬空滴加50–100μl洗脱缓冲液EB，室温放置2分钟，10,000g离心2分钟将质粒溶液收集到离心管中，-20℃保存。

【注】

● 为了增加质粒的回收效率，可将得到的洗脱液重新加入离心吸附柱中，再次离心收集。

● 洗脱缓冲液体积不应少于50 μl，体积过小影响回收效率。

● 洗脱液的pH值对于洗脱效率有很大影响。若用水做洗脱液应保证其pH值在7.0-8.5范围内，pH值低于7.0会降低洗脱效率。

不使用LysisDye的标准操作步骤：

如非指出，所有离心步骤均为使用台式离心机在室温下离心。

1. 取1–5 ml过夜培养的菌液加入离心管中，10,000 g离心1分钟，尽量吸除上清。注：菌液较多时可以通过几次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中。

2.向菌体沉淀的离心管中加入250μl溶液P1（请先检查是否已加入RNaseA），使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀。注：如果有未彻底混匀的菌块，会影响裂解，导致提取量和纯度偏低。

3. 加入250 μl溶液P2，温和地上下翻转6–8次使菌体充分裂解。注：温和地混合，不要剧烈震荡，以免污染基因组DNA；所用时间**不应超过5分钟，以免质粒受到破坏。

4. 加入350μl溶液P3，立即温和地上下翻转6–8次，充分混匀，此时会出现白色絮状沉淀。10,000g离心10分钟。注：P3加入后应立即混合，避免产生局部沉淀。如果上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清。

5.小心地将上清转移到吸附柱CP中（吸附柱放入收集管中），10,000g离心30–60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP重新放回收集管中。

6. 向吸附柱CP中加入500 μl去蛋白液PD，10,000g离心30秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP重新放回收集管中。

7. 向吸附柱CP中加入700μl漂洗液PW（请先检查是否已加入无水乙醇），10,000g离心30–60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP重新放回收集管中。

8. 向吸附柱CP中加入500 μl漂洗液PW，10,000g 离心30–60秒，倒掉收集管中的废液。

9. 将吸附柱CP置于收集管中，10,000g 离心2分钟。注：此步骤目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，**不可省略，因为漂洗液中乙醇的残留会影响后续实验（酶切，PCR等）。

10.将吸附柱CP置于一个干净的1.5ml离心管中，向吸附膜的中央部位悬空滴加50–100μl洗脱缓冲液EB，室温放置2分钟，10,000g离心2分钟将质粒溶液收集到离心管中，-20℃保存。

【注】

● 为了增加质粒的回收效率，可将得到的洗脱液重新加入离心吸附柱中，再次离心收集。

● 洗脱缓冲液体积不应少于50 μl，体积过小影响回收效率。

● 洗脱液的pH值对于洗脱效率有很大影响。若用水做洗脱液应保证其pH值在7.0-8.5范围内，pH值低于7.0会降低洗脱效率。

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